la proteina fluorescente verde (gfp) è una specie di proteina bioluminescente, presente nei celenterati. gfp è facile da rilevare, alta sensibilità, proprietà di fluorescenza stabile, forte tolleranza, facile da esprimere, senza citotossicità, utilizzato per il rilevamento di cellule viventi. pertanto, gfp può essere utilizzato come gene reporter per rilevare l'espressione o la regolazione del gene o come etichetta di fusione per rilevare la localizzazione, la migrazione, il cambiamento di conformazione e l'interazione intermolecolare della molecola proteica o il marcatore bersaglio di alcuni organelli. il picco massimo dello spettro di assorbimento del gfp è 395 nm (uv) e con un picco di assorbimento vice 470 nm (raggio blu). il picco massimo dello spettro di emissione è 509nm (raggio verde) e con un picco laterale di 540 nm (shouder). 450nm-490nm è solo il picco di assorbimento del gfp, ma poiché la luce di eccitazione fa meno danni alle cellule, la banda viene solitamente utilizzata più frequentemente (principalmente 488 nm). inoltre, le proprietà dello spettro di GFP sono simili a isotiocianato di fluoresceina (fitc), entrambi di solito hanno un set di filtri. la fluorescenza gfp è estremamente stabile. sotto la luce di eccitazione, la capacità di sbiancamento fotografico gfp è più forte della fluoresceina. in particolare, è più stabile all'onda del raggio blu di 450nm-490nm. allo stesso modo, la sensibilità della fluorescenza della proteina di fusione gfp è superiore all'anticorpo fluorescente dell'etichettatura fluorocromo, è una forte capacità di sbiancamento anti-luce, che è più adatta per la determinazione e l'analisi quantitativa. la generazione di fluorescenza gfp non necessita di alcun substrato di reazione esogeno. quindi, gfp come una proteina reporter vivente ampiamente applicata, il suo effetto è ineguagliato da qualsiasi altra proteina reporter enzimatica. tuttavia, gfp non è un enzima. il segnale di fluorescenza non ha effetti di amplificazione enzimatica. quindi, la sensibilità del gfp è inferiore rispetto ad altre proteine ​​reporter enzimatiche, come la luciferasi lucciola.

i modi di osservare gfp:

Fonte di luce di eccitazione 1.portable gfp

utilizzando la sorgente di luce portatile di eccitazione gfp è il metodo di osservazione più conveniente e più veloce (chiamato specchio di osservazione della proteina fluorescente). poiché il gfp ha un picco di assorbimento più alto su 470 nm, l'uso di una sorgente luminosa di eccitazione a 470 nm può stimolare il gfp a emettere una fluorescenza verde brillante. dobbiamo indossare un vetro di osservazione professionale per osservare il chiaro segnale di fluorescenza quando osserviamo fluorescenza gfp . la ragione è che la luce di eccitazione è intensa luce blu.

Fonte di luce 2.uv

usando la fonte di luce UV (chiamata lampada spia uv , lampada a luce nera) è anche molto conveniente. ma se osservate la pianta, il verde frondoso del fogliame della pianta si illumina anche sotto la luce ultravioletta. interferirà per fluorescenza gfp . inoltre, i campioni possono anche causare danni ai campioni di gfp sotto la luce UV.

3. microscopio a fluorescenza

Il microscopio a fluorescenza si basa su uv come sorgente di luce, viene utilizzato per irradiare l'oggetto rilevato, renderlo fluorescente, quindi osserva la forma e la posizione dell'oggetto al microscopio. Il microscopio a fluorescenza viene utilizzato per ricercare l'assorbimento di sostanze intracellulari, il trasporto, la distribuzione e la localizzazione di sostanze chimiche. alcune sostanze nella cellula, come il verde foglia, possono fluorescenza dopo l'irradiazione della luce ultravioletta. altre sostanze, non hanno una fluorescenza in sé, ma se la tingete con un colorante fluorescente o un anticorpo fluorescente, possono anche fluorescenza per la luce ultravioletta. il microscopio a fluorescenza è uno degli strumenti per la ricerca qualitativa e quantitativa su tali sostanze. allo stato attuale, il metodo popolare utilizza l'osservazione al microscopio a fluorescenza. il microscopio a fluorescenza è molto popolare in laboratorio. ma l'unica deficienza è che le fette di foglia o di animale devono essere raccolte per l'osservazione, che distruggerà gli esemplari colti e non può osservare la vivipersione.

analisi completa, è il metodo più rapido e conveniente per osservare gfp adottando la sorgente luminosa portatile di eccitazione gfp (chiamata bios-cope transgenica).